专家指南：miRNA分析中的qRT-PCR疑难解答（下）[心得点评]

在miRNA分析中，实时定量PCR是一个有力的工具。不过对于具体的问题，例如怎么设计引物，如何确定Ct值，如何区分前体和成熟的miRNA，你可能还是有一堆问号。那就进来看看吧，专家为你答疑解惑。

续上篇：专家指南：miRNA分析中的qRT-PCR疑难解答（上）

Q4：你如何确定检测效率？怎样称之为好的效率？

John Rasko &Stephane Flamant
为了确定这个实验方案，我们使用了10倍连续稀释的let-7f合成寡核苷酸。当起始物质低至70飞克时，let-7f都可以检测到。

Thomas Schmittgen
谈到效率，这可是一个棘手的问题，尤其是对几百个不同的microRNA进行图谱分析时。由于ABI的不同TaqMan assays中引物及长度都是相似的，那么效率也或多或少相同。估计效率的简便方法就是比较PCR曲线的形状。相似的形状意味着相似的PCR效率。如果真正计算PCR效率，就要扩增10倍连续稀释的cDNA。然后就Ct值对稀释对数做图。效率等于10-1/斜率。效率在1.85-2.05这个范围都是可以接受的。

Frank Slack, Phong Trang, & Joanna Weidhaas
我们通过连续稀释microRNA标准来确定PCR反应的效率。每3.3个循环阈值表现为10倍扩增，那么效率就达到了100%。如果一个对数扩增需要3.3个Ct以上，那么效率就低一些。好的效率应该是在90%或以上。

M.Azim Surani & Fuchou Tang
对于反转录反应来说，只有6-8nt的引物与microRNA的3’端配对，其检测效率差异很大。为了定量确定每个细胞中microRNA的绝对拷贝数，我们通过连续稀释的模板绘制标准曲线。虽然绝对的检测效率差异很大，但不同microRNA标准曲线的斜率还是相似的。因此，图谱研究的相对定量也是准确的，因为它是基于△Ct值的。

Wei Yan
我们是通过www.stratagene.com/techtoolbox/calc/qpcr_slope_eff.aspx（Stratagene）上的效率计算器将qPCR标准曲线的斜率转化成效率。好的效率介于90～110%之间，对应的斜率是-3.1～-3.6。

Q5：如何区分前体和成熟的miRNA？

John Rasko & Stephane Flamant
在microRNA分析之前，我们首先通过经典的RT-PCR来分析，用同样的5’ microRNA特异引物和3’ 接头特异引物来扩增，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。只有那些能扩增出预期大小如95bp左右的引物才用于qPCR。如果PCR产物大于理论值，我们会优化PCR条件或设计新的5’引物。

Thomas Schmittgen
在2004年，我们发表了第一个定量microRNA的PCR方法。那个方法适用于定量microRNA前体。我们原本认为在某个特定的细胞或组织中，前体与成熟microRNA的量接近。在一些情况下是这样，但随着我们进行了更多的图谱分析，我们发现很多时候存在相当多的前体，却没有成熟的microRNA。于是我们使用自己的PCR分析来检测前体，用ABI的TaqMan assay来检测成熟的microRNA。

Frank Slack, Phong Trang, & Joanna Weidhaas
利用TaqMan实时分析，你应当设计两套不同的引物组和探针来检测前体和成熟microRNA。对于成熟的microRNA，你可以使用茎环结构的引物，对于前体，我想可以使用常规的引物，因为序列很长。

M.Azim Surani & Fuchou Tang
我们利用茎环结构的引物来进行microRNA定量，它只针对成熟的microRNA。它不能转录前体microRNA，因此pri-microRNA和pre-microRNA不会转变成cDNA，也就不会干扰成熟microRNA的定量。

Wei Yan
在qPCR之后，所有的PCR产物都去跑一个2%的琼脂糖胶，看看是否是单一条带，大小是否正确。成熟microRNA与前体microRNA的大小不同，在凝胶中会明显分开。包含microRNA的PCR产物大约为120bp，而包含pre-microRNA的产物则在170bp左右。不过，我们的PCR方法优先扩增成熟的microRNA。我们利用它分析了140多个microRNA的表达图谱，从没检测到pre-microRNA。

Q6：还需要其他的定量分析来进行补充吗？

John Rasko & Stephane Flamant
实际上我们的定量分析是作为普通RT-PCR的补充来获得定量数据，也可以进行半定量PCR。我们还做microRNA芯片实验，另外，我们用实时定量PCR来验证候选的microRNA。

Thomas Schmittgen
偶尔会做northern blot。我们会用northern blot来帮助确认前体microRNA是否存在于反应中。因为northern blot能很好地区分pri-microRNA和pre-microRNA，因此很有用。

Frank Slack, Phong Trang, & Joanna Weidhaas
如果我有足够的样品，而microRNA的水平足够高，我想我会做northern来检测。用northern来检测microRNA也是一个金标准。

M.Azim Surani & Fuchou Tang
我们通常会用基于实时定量PCR的microRNA图谱分析来核对样品中已知microRNA的表达，以及发现分化表达的候选microRNA。然后再做单个的定量PCR，用茎环结构的引物来检查一系列样品中的候选microRNA表达，以确认它们的生物相关性。

Wei Yan
如果是第一次做定量PCR或半定量PCR的话，就需要另一种定量分析如northern blot或RNA保护分析来证明qPCR的结果。至少要做3个样品，来看看定量结果能不能用另一种方法重现。

（生物通 余亮）